این فایل دارای فرمت word به طور کامل  و قابل ویرایش می باشد.

                           موضوع: ویروس شناسی و بیماری آنفلوانزای طیور

مقدمه

ارتومیسکوویروس ها یاویروس های آنفلونزاحامل نوعی بیماری بسیارواگیر هستند که دردستگاههای تنفس،گوارش واعصاب جایگزین می شوندوگاهی درطیورمرگ ومیربسیارشدیدی ایجادمی نمایند.

این ویروس ها به دوپاتوتیپ ویروسهای آنفولانزا با قدرت بیماری زایی شدید ((HPAIوویروس های آنفلوانزا با قدرت بیماریزایی کم یا متوسط (nHPAI) یا (mPAI) تقسیم می گردند.عفونت آنفلوانزا در گونه های مختلف پرندگان دریایی مهاجر وآبزی درسرتاسردنیا مشاهده شده است واین پرندگان به عنوان مخزن ومنبع ویروسهای آنفلوانزای طیورمحسوب می شوند.اگرچه ویروسهای  nHPAIازبیشترگونه های پرندگان اهلی جداشده اند ولی صنعت مرغداری وبوقلمون تا کنون بیشترین خسارات حاصله ازآنفلوانزارا متحمل شده است. ژنوم ویروس های آنفلوانزا حاوی RNAوهشت قطعه ای است. به همین دلیل بازارایی ژنتیکی در این ویروس ها زیاداتفاق می افتدوبه عنوان سدی بزرگ درراه کنترل وپیشگیری بیماری به حساب می اید .

براساس پادگن های نوکلئوکپسید یاماتریکس ، ویروسهای آنفلوانزابه سه تیپ AوBوCطبقه بندی می شوند وتیپ A، عامل اکثرهمه گیری های آنفلوانزا درطیورودام ها و همچنین عامل مرگ میلیونها انسان درقرن حاضر بوده است. مهمترین پادگن های سطحی ویروس آنفلوانزا ، هما گلوتینین (HA) ونورامینیداز(NA) می باشند. براساس این پادگن ها ، تا کنون 15 تحت سروتیپ Hونه تحت سروتیپ Nگزارش شده است. کلیه تحت سروتیپ های ویروس های آنفلوانزا ازپرندگان اهلی جدا شده اند . ویروس های آنفلوانزا دردستگاه تنفس وگوارش پرندگان آلوده تکثیر پیدا می کنند وانتقال مستقیم ویروس ازپرنده ای به پرنده ی دیگر ازطریق آئروسل و ذرات معلق منتشره ازدستگاه تنفس و مدفوع وانتقال غیرمستقیم ازطریق آب یاغذای آلوده انجام می گیرد. روند شکسته شدن HAبه دومولکول HA1وHA2در بیماریزایی ویروس نقش مهمی دارد که به حضوریا عدم حضورپروتئازها دردستگاه گوارش و تنفس طیوربستگی دارد. تشخیص آزمایشگاهی عفونت آنفلوانزابراساس آزمایش های سرم شناسی ، ویروس شناسی ومولکولی می باشد. به دنبال جدا سازی ویروس های آنفلوانزا ، تیپ وسرو تیپ آن الزاماً مشخص می شود وپاتوتیپ آن باید توسط آزمایش های  InvitroوInvivoمورد ارزیابی قرار گیرد. جداسازی ویروس های HPAIیا ویروسهای متعلق به تحت سرو تیپ های H5و H7باید به اطلاع مراجع ذیصلاح ملی و بین المللی دامپزشکی رسانده شود. به دلیل آنکه پرندگان دریایی مهاجروابزی به راحتی می توانند به طورهمزمان با ویروس هایی که ازنظر پادگن های HوN، متفاوت هستند ، آلوده شوند ، لذا آنفلوانزای طیوراحتمالاًهمیشه به عنوان یک بیماری غیرقابل پیش بینی باقی خواهد ماند. مهمترین اقدام دربرنامه ی پیشگیری و کنترل آنفلوانزا ممانعت ازتماس پرندگان دریایی و مهاجروآبزی با گله های ماکیان ، بوقلمون و مرقابی می باشد. بلا فاصله بعد از ورود ویروس های آنفلوانزا به یک منطقه ، انجام سیا ست های کشتار، قرنطینه و واکسیناسیون ، احتمال انتشارویروس ازیک منطقه به منطقه دیگررابه شدت کاهش می دهد.

درمجموع برای بررسی و شناسایی بیماری ، نیاز به فراورده های سرمی است. بنابراین موسسه ی واکسن و سرم سازی رازی اقدام به تهیه آنتی سرم اختصاصی پروتئین هما گلوتینین ویروس آنفلوانزای سویه ی N2 H9شایع درایران نمود تا به عنوان کنترل مثبت برای سرم های مجهول درآزمایش های تشخیصی به کار گرفته شود.

خلاصه فارسی:

برای تشخیص سرولوژیکی عفونت های آنفلوانزای طیور, روش های آزمایشگاهی مختلفی ازجمله آزمایش ممانعت ازهماگلونیناسیون(HI) ، ممانعت ازنورامینیداز(NI) ، رسوب برروی ژل آگار(AGP) والیزا (ELISA) بکارمی رود که بااستفاده ازاین آزمایشات می توان تیپ وتحت تیپ ویروس آنفلوانزارامشخص کرد.

باتوجه به گسترش بیماری آنفلوانزادرسطح کشوروبروزاپیدمی های اخیربیماری درصنعت طیورایران ، ارائه ی راه حلی برای تشخیص سریع بیماری درمرغداری هاجهت اجرای برنامه های کنترلی واحتمالاًریشه کنی ضروری است. چنین برنامه هایی بااستفاده ازآنتی ژن هاوآنتی سرم های وارداتی انجام می شودکه این فراورده هاباصرف هزینه های هنگفتی تهیه می شوندوبا توجه به اینکه تحت تیپ ویروس آنفلوانزای شایع درایران H9N2می باشد ، موسسه ی تحقیقات واکسن وسرم سازی رازی تصمیم به تهیه وارزیابی آنتی ژن وآنتی سرم اختصاصیH9جهت استفاده درآزمایش های مختلف کنترلی وتشخیصی نمود.

اهمیت اقتصادی بیماری:

ضررهای اقتصادی ناشی از آنفلوانزای مرغی ، سویه ی ویروس گونه های پرندگان آلوده ، تعداد مزارع درگیر، روشهای کنترلی مورداستفاده وسرعت انجام برنامه هایی کنترلی وریشه کنی ، بستگی دارد. دراکثرکشورهای پیشرفته ، HPAIوMPدرصنعت طیورتجاری ، بیماری های بومی نمی باشند. شیوع بیماری وضررهای اقتصادی ناشی ازآن ، درهمه گیری های MPAIیا HPدرطیورتجاری وغالباً درماکیان وبوقلمون هاروی داده است. بعضی ازکشورهای پیشرفته ، همه گیری های بومی MPAIرادر طیورصنعتی خود دارند ودر بعضی از این کشورها ، MPAIبصورت بومی در سیستم های بازار محلی طیور (بازار طیورزنده) وسیستم پرورش طیوردرخانه که اقوام بومی نواحی  وابسته به مراکزشهری ،ایجاد می کنند ، دیده می شود. اصطلاح LPM  به جای اصطلاح پرندگان زنده استفاده می شود.

ضررهای ناشی ازوقوع همه گیری های HPAIدرطیور اهلی در مزارع تجاری تولیدی یا درطیورسیستم های LPMوسیع می باشد . ضررهای مستقیم شیوع HPAIشامل هزینه های حذف طیور، ضررهای واگیری ومرگ و میر،هزینه های قرنطینه و نظارت بهداشتی وپرداخت غرامت برای حذف پرنده های بازاری زنده می باشد .

همه گیری های MPAI، زیانهای اقتصادی عمده ای را برای تولیدکنندگان بوقلمون و مرغابی، مخصوصاً زمانی که با عوامل بیماری زای ویروسی یا باکتریایی ثانویه همراه باشند ، در پی دارد. درکل زیان های ناشی ازاین دسته در مقایسه باHPAI  کمتر می باشد ، زیرا گله های آلوده ، با یک برنامه کنترلی ، حذف می گردندوواگیری آنها کمترمی باشد وتجارت ملی و بین المللی معمولاًاسیبی نمی بیند.    [1]

اهمیت بیماری از نظرسلامت عمومی:

درحالت کلی ، ویروس های آنفلوانزا ، به هنگام انتقال ، با میزان خود وبا افراد همان گونه  وگاهی اوقات درانتقال بین گونه ای ، با گونه های که قرابت نزدیکی دارند ، سازگارمی شوند . در موارد نادری ، ویروسهای A  Iقابلیت انتقال پذیری به انسان را نشان داده اند.

ازنظرتجربی ، ویروس های AIمختلف ، نشان داده شده است که توانایی محدودی برای تکثیردردستگاه تنفسی فوقانی انسان هادارند ، اگرچه درمواردنادری ، انتقال ویروس های AIبه انسان به دوروش مجزاصورت گرفته است : 1) انتقال کل ژنوم ویروسAIو 2)انتقال قطعات ژنی ویروسAI.

مواردانفرادی انتقال تمام ژنوم ویروس هایAI به انسان ، اثبات شده اند. با این وجودچنین مواردی درمقایسه با ویروس های آنفلوانزای سازش یافته باانسان که هرساله ودرطی پاندمیک های بیماری ، روی می دهد ، بندرت می توانند صدهامیلیون نفررادرگیرسازند . مواردانتقال ویروس های آنفلوانزای خوکی به انسان ، درمقایسه باانتقال ویروس های AI، بیشترگزارش شده اند ، امااین امرزیادمعمول نمی باشد. این تفاوت اندک درانتقال پذیری ویروس آنفلوانزای مرغی وخوکی ، ممکن است ناشی ازتفاوت خصوصیات گیرنده های سلولی اپی تلیوم دستگاه تنفسی باشد. ویروس های AIبه صورت خاصی به –acetylneuraminic acid–galactose α N–2,3 متصل به گیرنده هایSialoligosaccharide  (اتصال3,2  α) ، باندمی شوند ، درحالی که ویروس های آنفلوانزای خوکی وانسانی بهglactose α N-acetylneuraminic acid-2,6

متصل به گیرنده های Sialoligosaccharide(اتصال 2,6 α)باندمی گردند ، اپی تیلیوم تنفسی پرندگان غالباً اتصال α2,3 رادارد ، درحالی که اپی تلیوم تنفسی انسان دارای اتصال α2,6 واپی تلیوم تنفسی خوک دارای مخلوطی ازاتصال α2,3 و α2,6 است. این امرممکن دلیل تعداد موارد بیشترانتقال آنفلوانزای خوکی به انسان درمقایسه با آنفلوانزای مرغی به انسان ، باشد.

پنج موردازعفونت انسانی ، در اثر انتقال ویروسهایAIگزارش شده است. در1959یک مرد 46ساله ، هپاتیت عفونی پیشرفته ای را به دنبال مراجعت ازسفردوما هه دریایی از طریق آسیا ، آفریقا واروپا نشان داد.یک ویروس HPAI(H7N7) ازخون وی جداشد. بهبودیش کامل شد ، اما هیچ نوع انتی بادی خنثی کننده علیه ویروس های AIدر خون وی ، رد یابی نشد طی سالهای 1978تا1979 ، یک ویروس  (H7N7)MPAIباعث واگیری یک بیماری تنفسی و مرگ درچلچله های دریایی درشمال غربی ایالات متحده شد. کونژکتویت خود محدودی در کاراگرافی که با چلچله ها کارمی کردند به هنگام شیوع بیماری ، گزارش شد.

ساختمان و عملکرد هما گلو تینین:

پروتئین HIویروس انفلوانزا ، موجب اتصال ویروس به سلول های حساس می شود. HAمهم ترین پروتئینی است که آنتی بادی های خنثی کننده برضد آن ساخته می شوند. تغییرات این پروتئین ، موجب پیدایش سویه های جدید ویروس و اپیدمی های بعدی آنفلوازا می گردد. نام هما گلو تینین ازتوانایی این پروتئین درآگلوتینه کردن گلبولهای قرمزدر شرایط خاص گرفته شده است. می توان چینش اسید های امینه ی HAرااز چینش ژن ان ، مشخص کرد وبا کمک کریستالوگرافی اشعه ی Xساختمان سه بعدی پروتئین را تعیین نمود و بدین ترتیب رابطه بین عملکرد HA  وساختمان آن را مشخص کرد. پروتئین HA   حاوی566 اسید آمینه است (شکل4-2). یک سیگنمال کوتاه در آمینو ترمینال ، باعث راهیابی این پلی پپتید به شبکه آندوپلاسمیک می شود وسپس سرانجام سیگنال حذف می گردد. ازبرش پروتئین HA، دو زیر واحد HA1و HA2حاصل می شود که به کمک پیوند دی سولفیدی ارتباطشان را با یکدیگر به طور محکمی حفظ می کنند. زنجیره ی هیدرو فوبی که در نزدیکی کربوکسی ترمینال HA2قرار دارد ، باعث اتصال مولکول HA  به غشاء سلول می شود و دنبا له ی هیدروفیل کوتاه را درسیتوپلاسم قرارمی دهد. ذرات اولیگوساکاریدی درچندین نقطه به مولکول HA  اضافه می شوند.

مولکول HAپس از تابیده شدن برروی خود ، ساختمان پیچیده ای راتشکیل می دهد. دایمرهای HA1و HA2ساقه ی درازی را تشکیل می دهند که پایه ی آن برروی غشا ی سلول و گلبول بزرگی نیز درراس آن قرار می گیرد ، پنج مکان آنتی ژنی واقع برروی مولکول HAدچار جهش های گسترده ای می شوند. این مکان ها درساختمان سطحی ویروس قرار گرفته اند ودرپایداری مولکول HAنقشی ندارند ، اما درخنثی سازی ویروس توسط میزبان دخالت می کنند . مکان های دیگر مولکول HAدر تمامی سویه ها بدون تغییرباقی می مانند . احتمالاً وجود این مکان ها برای حفظ ساختمان و عملکرد ویروس ضروری است .

برجستگی HAواقع برروی ذره ی ویروس ، تریمری است که ازدو مولکول HA2ودر بین انها یک مولکول HA1تشکیل شده است (شکل4-2) . تریمر بودن HAدر مقایسه با حالت منومری ان ، موجب پایداری بیشتر این مولکول می شود. گیرنده مولکول  HAکه به سطح سلول اتصال می یابد ، بصورت پوشش دار ، در راس هر یک از گلبولهای بزرگ قرارمی گیردوآنتی بادی ها به آن دسترسی ندارند.

پروتئازهای سلولی ،مولکول HA  را به قطعات HA1و HA2برش می دهند. این برش برای عفونت زایی ذره ویروسی ، ضروری است. از انجایی که آنزیم های پروتئاز دردستگاه تنفسی به میزان بیشتری وجود دارند ، ویروس های آنفلوانزا به طور طبیعی در این مناطق ایجاد بیماری می کنند. ویروس هایی که ازآنزیم های منتشری نظیر پلاسمی برای بریدن مولکول  HAاستفاده می کنند ، توانایی آلوده کردن سلول های بیشتری رادارند.آمینو ترمینال HA2ازبریده شدن مولکول HAتولید می شود وحضورآن برای تلفیق پوشش ویروس و غشاء سلول میزبان که یک مرحله ی اساسی درعفونت زایی ویروس است ، ضروری می باشد. pHاسیدی باعث تغییراتی در ساختمان ذره ویروسی می شود و بدین ترتیب موجب تلفیق ویریون با سلول میزبان می گردد. (میکروبیولوژی پزشکی جاوتز، ترجمه سعید صالحی و همکاران ، 1381 )

اثرهما گلوتینین در بیماری زایی:

ژن HA، عامل تعیین کننده ی عمده بیماری زایی شدید در ماکیان است. اما همکاری مناسب تمام هشت قطعه ی ژنی برای ایجاد حداکثر پتانسیل بیماری زایی ، ضروری و مورد نیاز است. به صورت خلاصه شکسته شدن HAبه پروتئین های HA1و HA2برای عفونت زایی ویروس وایجاد سیکل های تکثیر ضروری است . در مورد ویرس های MPAI، پروتئاز های شبیه تریپسین که درجاهای آنا تومیکی محدودی مانند لومن تنفسی و اپی تلیوم روده ا ی یا در ترشحات لومن نتفسی یافت می شوند ، برای شکسته شدنHA  ودزنهایت ایجاد

 ویروس عفونس ، ضروری اند. محل شکستگی پروتئولیتیک HAویروس های MPAIدارای یک اسید آمینه ی بازی منفرد(آرژینین)درانتهای کربوکسی HA1و یک محل گلیکولیزاسیون در اسیدآمینه ی شماره ی13 می باشدکه محل شکستگی پروتئولیتیکی را محافظت می کند. در مقابل ویروس هایHPAI  ،HAایدارند که بوسیله ی پروتئازهای Furinموجود دراکثر سلول های اعضاءاحشایی،سیستم عصبی وسیستم قلبی عروقی ، شکسته می شود.

آنزیم های شبه تریپسین نیزHAویروس های HPAIرا خواهند شکست. این ویروس ها دارای ساختار محل شکستگی پرئتئولیتیکی HAای باجانشین شونده ها یا ضمائمی ازچندین اسید آمینه ی بازی در انتهای کربوکسیHA1   وعدم امکان محافظت محل گلیکولیزاسیون دز اسیدآمینه ی شماره ی 13 می باشند. برای مثال ویروس H7N12000-1999 ایتالیا ، زائدهای متشکل ازپنج اسید آمینه (دو اسید آمینه ی بازی) درمحل شکافت پروتئولیتیکی داشت.H5N21995 مکزیکو دارای هر دوی جانشین شونده ها و زوائدی ازاسیدهای آمینه بازی در محل شکافت پروتئولیکی است وH5N21984-1983 ایالات متحده ، واجدجانشین شونده هایی از13 اسید آمینه ی بازی درمحل شکافت وفاقدمحل گلیکولیزاسیون دراسید آمینه شماره ی13 می باشد. ذرتست های آزمایشگاهی ، پیش بینی پتانسیل بیماریزایی (یعنی احتمال اینکه یک ویروس MP  خاص تبدیل بهHPخواهد شد) براساس تغییرات ساختاری درمحل شکستگی پروتئولیتیکی هماگلوتینین وحساسیت آن به شکسته شدن بوسیله ی آنزیم های مختلف دربافت های گوناگون می باشد. برای مثال توانایی ایجاد پلا کهای بزرگ درمحیط کشت بافتی مانند محیط کشت فیبرو بلاست جنین جوجه بدون اضافه کردن تریپسین با شکسته شدن فورینی HAوhpدرآزمایشاتinvivo درجوجه ها همبستگی دارد. اما ویروس های MPAIنیازمند اضافه کردن تریپسین خارجی برای شکسته شدن HAوایجاد پلاکهای بزرگ هستند. تشخیص HA ی شکسته شده درمحیط های کشت سلولی –بافتی بدون تریپسین بوسیله ی radioimmuno precitationبا HPبدون ویروس همبستگی دارد. تمام ویروس های HPAIوMPدرتخم مرغ های جنین دار، تولیدHAشکسته شده را می کنند. شناسایی اسید های آمینه ی بازی درمحل شکستگی پروتئولیتیکی HAباHPبا پتانسیزل تبدیل ویروس به HPهمبستگی دارد. علاوه بر این ، توانایی شکسته شدن HA، با اتصال گیرنده ای بین محل اتصال به گیرنده ی HAو گیرنده ی درسلول های میزبان ،اهمیت دارد. دانسته ها درمورد این پدیده کم می باشد. اما تحت تاثیرهردوی خصوصیات میزبان(آداپتاسیون میزبانی) وتروپیسم سلولی یا بافتی در بدن میزبان می باشد.این امرممکن است تکثیر ویروس رامحدود به سلولها ،بافت ها واعضا خاص نماید. نشان داده شده است که تغییرات درمحل اتصال به کیرنده ی HA، دامنه ی میزبانی یک ویروس آنفلوانزا را تغییرمی دهد.

مکانیسم های پاتو بیولوژی سلولی: براساس شواهد بیوشیمیایی ومورفولوژیکی ، ویروس های AIبا دو مکانیسم اثرپاتولوژیکی خود را بر روی سلول هایمرغی ، اعمال می کنند: نکروزو آپوتپوز.نکروز در انواع سلولها از جمله سلول های توبول کلیوی ، اپی تلیوم آسینی پانکراس ، میوسیت های قلبی سلول های قشری آدرنال(فوق کلیه)و سلول های اپی تلیال ریوی،تشخیص داده شده است.

نکروزمرتبط با تکثیرشدید ویروس و اجتماع نوکلئو پروتئین ویروسی AIدر هسته وسیتوپلاسم سلول است. مرگ سلول آپوپتوتیک درسیستم های کشت سلولی مختلف اثبات شده است. و چندین سیتوکائین شامل trasforming growth factor-betaوinterferon-betaدراین مورد دخالت دارند. در بدن موجود زنده ،مرگ سلولی آپوپتوتیک ،اغلب در لنفوسیت ها مخصوصاً به هنگام عدم وجود تکثیر ویروسی AIمستقیم،تشخیص داده می شود. با این وجود آپوپتوزدرنورون ها ، اپی تلیوم تنفسی وسلو لهای آلوئولهای ریوی موش آلوده شده با ویروس های آنفلوانزای آداپته شده با موش که تکثیر ویروس آنفلوانزا را داشت ، اثبات گردیده است. درجنین های جوجه ، آپتوپتوزونکروزممکن است تظاهرات بیو شیمیایی مشابهی داشته باشند. واین امر نشان می دهد که تمایز این دو ازهم همیشه آسان نمی باشد و یا بدرستی صورت نمی گیرد.

منابع فارسی

 1- اکبر آزاد ، گیتا و وصفی مرندی ، مهدی (1382) مکانیسم های بیماریزایی ویروسهای آنفلوانزای طیور ، مجله ی چکاوک ، دوره ی دوازدهم ، شماره ی یک ، صفحات64-33.

2- بروکس ،جورج فدریک ، میکروبیولوژی پزشکی جاوتز. (ترجمه ی سعید صالحی وهمکاران) (1381) . صفحات 537-526. انتشارات تیمورزاده .

3- شیمی ، احمد (1375) ویروس شناسی دامپزشکی ، چاپ اول ، صفحات 114-99 و351-335 . انتشارات دانشگاه تهران

4- وصفی مرندی ، مهدی و بزرگمهری فرد ، محمد حسن (1377) عفونت های ناشی ازویروسهای آنفلوانزا یا ارتومیکسوویروس ها درطیور ، دام ها وانسان . مجله ی چکاوک ،دوره ی هفتم ، شماره ی یک ، صفحات 59-27.

5- وصفی مرندی ، مهدی و اکبری آزاد ، گیتا (1382) ایمنی وواکسیناسیون دربیماری آنفلوانزای طیور ، مجله ی چکاوک ، دوره ی دوازدهم ، شماره ی 1 ، صفحات 91-65

منابع انگلیسی :

1-Adair .B . M & etal . (1989).Detection of influenza A type Spesific antibodies in Chicken and turkey sera by enzyme Linked immunosorbent assay . Avain pathology No19 . PP:455-463

2-Alexander.   D.j. ; Gough , R.E (1986) .Isolation of avian influenza virus from in Great Britain . Vet ree . No 118 . PP : 537-538

3-Alexander , D . j . (1993) . Orthomyxovirus infection. In : Virus infections of bifds . J . B McFerran ; M . S . Mcnulty . PP. :287-316 (Elsevier Science Publisheres B . v .New yord , USA)

4-Arora , d.JIT . S & etcal . (1985). Concentration and purification of influenza virus fram allantoic fluid Analytical biochemistry . Vol 144.PP:182 (Academic press . Inc)

5-Beard , C . w (1970) Avian influenza antibody detection by immunodiffusion . Bull WHO NO42. PP : 779-785

Bernard . D . (1990) . Microbiology. 4   edition (Lippincott company)-6

7-Brady . M, I . ; Furminger , I . G . S . (1976) . Journal of hygienc . Vol 77 ,NO2.PP. : 161-173 (Printed in great Britain).

8-Brugh , M . ; Stone , H.D (1987) . Immunization of Chicken against influenza with hemagglutinin – Specific (H5) Oil emulsion Vaccine.In proceeding of the second International Symposium on Avian influenza , Athens .PP : 283-292

9-Feenner , F & etal (1992) Veterinary Virology third edition . PP : 1353-1445 (Lippincott – Raven publishers , Philadel phia).

10-Harlow , E . ; Lane , D (1998) . Antibodies . Alaberatory manual. PP ; 53-139 (Cold Spring Harbor Laboratory ).

11-Heyward , j . T & etal (1977).The rapid concentration and purification of influenza Virs from allantoic fluid . Arch Virolo . No 55 . PP : 107-119

12-Hacart , M & etal (1995). Preparation and Characterization Purifeid influenza virus neuraminidase vaccine.  Vaccine vo113 .No 18.PP : 1793-1798 (Elsevier Science Ltd ).

13-Johansson , B  .  E & etal (1989). Purifeid influenza virus hemagglutinin and neurminidase are equivalent in Stimulation of antibody response but induce Contrasting types of immunity to infection. Jourmal of virology .vol63  .No 3 .PP : 1239-1246 (American Society for Microbiology)

14-Johnston , A.; Thrope , R (1996).Immunochemistry inpractice. PP :25-40 (Black well science).

15-Proceeding 4 International symposium on avian influenza (1997) . United states Animal Health Association , Athens , GA .

16-Robert , B . B (1991) . Textbook of Humman virolohy second Edition PP : 307-341 (Mosby yeat book) .

17-Swayne  D . E . ; Halvorson , D . A (2003) . Influenza , In : Disease of poultry (Saif , Y. m) PP : 135-160 (Lowa state preese).

18-Webster , R . ; Cox , N ; Stohr , K (2002) . WHO manual on animal influenza diagnosis and surveillance.